Церковь была возведена в 1539 году на месте деревянной, которая была закрыта в 1488 году во время сильной эпидемии. В 1639 году построили придел. В 1745 году она была отнесена к церкви Святого Василия на Горке. В 1786 году в документах было указано, что церковь полуразрушена от пожару, ее предназначалось упразднить.
В 1794 году была приписана к Ново-Вознесенской церкви и оставалась приписанной к ней до начала ХХ века. В 1808 году церковь хотели снести, так как она была совершенно ветхая. Но Синод запретил снос церкви.
В апреле 1842 года протоиерей Николай Милевский призвал жителей Пскова восстановить один из самых древних храмов города. К середине 1843 года на средства прихожан и Н.М. Постниковой, свояченицы старосты церкви, церковь была отреставрирована. 2 июля 1844 года она была освящена как храм Анастасии Узорешительницы. Восстановленная церковь стала одной из самых красивых в городе.
По документам начала ХХ века церковь названа по именам двух святых: Анастасии Римлянки и Анастасии Узорешительницы.
В 1917 году церковь была закрыта. Во время Великой Отечественной войны в церкви были повреждены кровля, стены, наружная и внутренняя отделка.
После длительного перерыва, 4 января 2007 года состоялось в день памяти великомученицы Анастасии Узорешительницы.